細胞培養(yǎng)注意事項（入門級）

總的原則：無菌操作、保證細胞培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定性

按時間順序整理

1、  細胞房和生物安全柜（或超凈工作臺）先開紫外照射30min。作用：對環(huán)境滅菌（空氣）。（備注：如果著急，至少也要開15分鐘）

在做實驗之前考慮好需要哪些物品。開始照射之前，將所需要用到的物品都放到生物安全柜（或超凈工作臺）里面。

常用移液槍或電動移液器等，需要在工作臺上放置一套設(shè)備。

細胞培養(yǎng)箱一般都已經(jīng)調(diào)整好。定期留意一下二氧化碳是否足夠。不夠及時更換。

2、  顯微鏡需要定期消毒酒精擦拭。注意：顯微鏡一般都放在細胞房。

3、  進入實驗之前，首先給自己帶上拖鞋、頭套，口罩，實驗服，手套（手套帶雙層）。注意：手套要將袖口套進去。實驗服、拖鞋是細胞房。

4、  開始操作之前先觀察細胞。

首先觀察細胞培養(yǎng)液的顏色。現(xiàn)在的細胞培養(yǎng)液通常都放有酸堿指示劑（絕大部分是酚紅）。細胞在培養(yǎng)生長過程中，不斷在培養(yǎng)液上清中累積酸性物質(zhì)，時間長了，培養(yǎng)液變?yōu)辄S色（同時培養(yǎng)液中營養(yǎng)物質(zhì)耗盡）。

其次鏡下觀察細胞的生長狀態(tài)是否良好，是否需要傳代。如果生長狀態(tài)不好，需要對培養(yǎng)液進行調(diào)整（一般是加大血清濃度）。過于密集出現(xiàn)大片融合或太密集而導(dǎo)致細胞脫落，則進行傳代。

如果長勢良好，且細胞培養(yǎng)液顏色未發(fā)生變化，可以酌情進行1/2、 1/3、1/4換液，也可以全換液。總之，視細胞生長情況而定。

5、  細胞培養(yǎng)預(yù)準備：

首先是準備各種溶液。

1：是配制溶液過程中要用到的水。水用純水，高壓滅菌之后，再去內(nèi)毒素。去內(nèi)毒素方法很多，簡單可以放在烘箱180度3小時。或者過去內(nèi)毒素的柱子后，高壓滅菌。

第二，各種溶液滅菌：

抗生素用去內(nèi)毒素水配制后，直接過濾除菌（過0.22u濾頭）。可以用一次性無菌注射器過一次性0.22u濾頭。

現(xiàn)在用的培養(yǎng)液，如果是商業(yè)化液體培養(yǎng)基，不用處理。如果是粉末，需要用去內(nèi)毒素水在生物安全柜（或超凈工作臺）進行配制，再過濾除菌。可以先配濃縮液（如10×），過濾除菌后。再用滅菌去內(nèi)毒素水稀釋成1×培養(yǎng)液。

第三，*培養(yǎng)液的配制：

培養(yǎng)液加上合適比例的血清即可。但血清一般保存于－20℃，一般解凍是放在4℃冰箱解凍，耗時長，而且必須解決*之后，才能進行*培養(yǎng)基的配制。所以要提前幾個小時就將血清從－20℃轉(zhuǎn)入4℃，以期*解凍。當然如果這一次就需要用完的話（是指用這些血清配制的培養(yǎng)液都用完），也可以放到37℃解凍。

第四，醉重要的是保證過程中無菌。

液體必須要分裝。無論過程中用到的培養(yǎng)液、胰酶、血清、PBS、生理鹽水、抗生素盡量分裝。分裝是為了防止污染。如果操作有誤，僅能威脅到其中一支，而非整個。

培養(yǎng)液、血清、PBS、生理鹽水分裝為20mL、50mL或100mL/管

胰酶、抗生素可分裝為1mL/管。

分裝先于細胞操作

第五，操作之前，培養(yǎng)液先放到37度的細胞培養(yǎng)箱里復(fù)溫。原因：盡量減少對細胞的刺激。低溫對于細胞也是一個刺激因素。

第六，操作之前，大腦先過一遍此次操作所需要用到的所有用具。將所有用具先放到無菌臺面上。減少拿入拿出的動作，保證無菌。（如果萬一發(fā)現(xiàn)少拿了什么，也不要緊，再加上就是。如果是槍頭盒、移液管等用具，先用消毒酒精噴一下）。

第七，操作之前，帶著的手套先噴消毒酒精。然后再進入工作臺。等一分鐘，等手套上的酒精揮發(fā)之后再進行操作。

6、  細胞培養(yǎng)操作過程：

注意無菌。無論哪一管液體，開蓋后盡量立即關(guān)上（如果有幾瓶都需要開的，也注意，可以虛蓋）。蓋子向上放。操作時不要從開蓋的容器上方經(jīng)過。另外，無菌臺面上擺放的各種東西，是一字擺開，平行于自己。盡量不要前后重疊

細胞操作中所用的所有耗材試劑都是細胞培養(yǎng)。一般都以一次性耗材居多。1ML槍頭為加長型培養(yǎng)槍頭。移液管亦有10mL一次性無菌移液管

（1）細胞換液：

培養(yǎng)皿/瓶用槍頭或移液管吸去原培養(yǎng)液，加入新培養(yǎng)液。

（2）細胞傳代：

傳代之前先觀察，細胞是否密集，是否開始融合。一般融合達到70－80%就可以傳代。早點傳代也可以。

如果是貼壁生長的細胞：

1）  培養(yǎng)皿/瓶用槍頭或移液管吸去原培養(yǎng)液；

2）  無菌PBS或無菌生理鹽水洗滌3次（按培養(yǎng)體積加入）；

3）  加入適量胰酶消化適當時間（一般胰酶為0.25%；9cm/10cm培養(yǎng)皿和25cm培養(yǎng)瓶，一次加入1mL胰酶。消化時間視細胞類型等多種情況綜合考慮，一般如果是細胞株，非原代培養(yǎng)，消化1－2分鐘足矣）；

4）  用槍頭吹打數(shù)十次（視細胞類型而定。一般細胞株30－50次吧，耗時一般2分鐘左右）；

5）  加入適量體積*培養(yǎng)基終止胰酶消化（如果是9cm/10cm培養(yǎng)皿和25cm培養(yǎng)瓶，可以加入1mL*培養(yǎng)基；現(xiàn)在培養(yǎng)瓶（皿）里有2mL溶液）。

6）  現(xiàn)在可以將溶液進行分瓶（2mL）。如果是細胞株，直接均分到兩個培養(yǎng)瓶（皿）里。如果是原代培養(yǎng)，可以根據(jù)消化時間來對細胞進行分離；因此可以將溶液（2mL）都轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)瓶（皿）。

7）  將兩個培養(yǎng)瓶（皿）補足*培養(yǎng)基到正常體積（果是9cm/10cm培養(yǎng)皿和25cm培養(yǎng)瓶，為5mL*培養(yǎng)液）

8）  鏡下觀察。剛剛傳代細胞還沒貼壁，懸浮在溶液中，呈圓形。一般2h之內(nèi)會貼壁，如果已經(jīng)貼壁，根據(jù)細胞類型有不同的形態(tài)，但通常都不是圓形。

9）  鏡下觀察無誤之后，再放入細胞培養(yǎng)箱。培養(yǎng)瓶（皿）放入之前，可以用消毒酒精先擦一下。

10）  傳代之后，第二天細胞換液一次。當然，也可以視情況而定。

7、  收拾工作臺。物品歸位，倒出垃圾。再開紫外照射30min

8、  其它注意事項：

1:，經(jīng)常觀察。是每天都顯微鏡下看一看，確定細胞狀態(tài)。然后該換液換，該傳代傳，不用理會的就原樣放回去。如果好幾天都不想理會，可以放不*培養(yǎng)基，或者低血清濃度的培養(yǎng)液，維持細胞生存，但不增殖。

第二，是否加抗生素。這個視情況而定。細胞培養(yǎng)過程中，是要求盡量少添加不相關(guān)的雜質(zhì)。抗生素對于細胞來說，也是一種負擔。但如果環(huán)境比較污染，直接添加好了。好比沒病不用吃藥，感冒了還是要吃藥；嬰兒沒病但還是要打疫苗。

第三，胎牛血清的解凍。血清一般保存于－20℃，要放在4℃冰箱解凍，耗時長，500mL要好幾個小時，我們經(jīng)常是頭天離開實驗室之前放到4℃冰箱，過夜。所以經(jīng)常分裝成10mL或者20mL。這樣，上午放到4℃冰箱，下午就可以用了。

第二，是否一定要細胞房。以及是否要*嚴格的遵守種種器具。這個吧，見仁見智。凡所有種種措施及設(shè)備都是為了保證培養(yǎng)操作過程中無菌，減少感染的機率；試劑耗材保證無菌無內(nèi)毒素。細胞房也是這么一個措施而已，其它試劑耗材也是；我們沒有專門的細胞房也這么養(yǎng)。

并不是說走夜路就一定會遇到鬼，當然走多了遲早遇到，如果總是遇不到，這個人運氣一定很好——。

剛開始我們實驗室也是沒有的生物安全柜和細胞房，拖鞋什么的也沒辦法，沒有加抗生素，照樣養(yǎng)得好好的。但是，交叉養(yǎng)，還是需要注意，一是時間上分隔開來：每天細胞培養(yǎng)先操作。其它細菌之類操作靠后，且操作后消毒酒精臺面消毒，紫外照射1小時。二是其它操作要小心，避免帶入污染。當然，如果有必要加抗生素，還是盡早加，比細胞污染了再去搶救要來得好。

（算是順便整理了一下，屬于入門級別的。）

@geraldorjerry：你好，你的意思是紫外線照過之后，實驗操作開始了，如果萬一發(fā)現(xiàn)少拿了什么，就直接酒精噴一下再放進去是嗎

@llh1245：有時確實是忘記，ZUI怕的就是那種實驗已經(jīng)做到一半忘記了的，或者發(fā)現(xiàn)東西不夠用的。我們一般是這樣處理：耗材、移液槍還有金屬器皿之類的，可以噴一下酒精放進來，等酒精風干一下，注意不要和其它東西混雜。反正一般細胞的也有外包裝，里面已經(jīng)是無菌無內(nèi)毒素。如果是試劑，那就是直接從冰箱拿出來放進來就是。（如果只是實驗還沒有真的開始，把漏掉的東西加上，再照30分鐘就是。）

@姚麗佳：請問傳代前，經(jīng)過胰酶處理后，加了培養(yǎng)基后不用離心直接分瓶嗎？那后面培養(yǎng)的時候不就含有胰蛋白酶了嗎？不會產(chǎn)生影響嗎？

@llh1245：是的，不用離心直接分瓶。之后加入含血清的培養(yǎng)基中止了胰酶作用。如果是貼壁細胞，一般第二天就貼壁了。分瓶后第二天再全部換液。如果是半懸浮細胞，一般都不用胰酶消化，都是直接吹下來。